小激活saRNA設計合成
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saRNA的分子機制及設計原則
saRNA作用于基因調控序列的特異位點,誘導基因轉錄,這已經得到學者們的普遍認同,并
成為新的腫瘤研究熱點。然而, RNAa的細胞分子機制目前尚不完全明確。saRNA- 般是
21 nt的外源性短雙鏈RNA。導入細胞質的saRNA與Ago-2 ( Argonaute-2 )蛋白形成
saRNA-Ago-2復合物。Ago- 2為saRNA-Ago-2復合物的形成提供平臺,并引愎合物進入細
胞核。saRNA-Ago- 2復合物在細胞質中形成,但其進入細胞核的機制仍不清楚。進入細胞核
的saRNA-Ago-2復合物在引導鏈的指引下靶向結合于DNA啟動子序列的特異位點,并通過組
蛋白修飾酶改變局部空間構象及組蛋白乙酰化狀態(tài),從而上調目的基因表達。研究表
明, saRNA誘導的基因激活可能受DNA超甲基化的影響,所以應避免saRNA靶序列中存在
CpG島。然而, DNA超甲基化對RNAa的抑制作用是否具有普遍性或基因特異性仍不明確。
RNAa誘導的基因表達上調需在saRNA轉染24 ~ 48 h后才能檢測到,在4~ 5 d后達到高峰,
并持續(xù)10 d以上。由此說明, RNAa具有獨特的動力學特征。目前,對于saRNA作用的具體分
子機制仍需要進一步研究。
RNAa涉及復雜的分子調節(jié)機制,可能影響RNAa效率的表觀遺傳因素尚不明確。因此，目前
對于saRNA并無規(guī)范的設計方法。綜合分析前期實驗和文獻報道，上海吉熒生物總結saRNA的設計原則如下:
(1)目標靶點選擇在DNA正義鏈序列上;
( 2 )與DNA正義鏈互補的RNA鏈作為導鏈,
DNA鏈的3’端與RNA鏈的5’ 端相對應;
( 3 ) saRNA靶點選取在轉錄起始點上游200 ~1 200 bp;
( 4 ) saRNA長度為21 bp ,在saRNA 3’端懸掛dTdT或者UU ;
( 5) GC含量為40%~65%;
( 6)靶片段中避免出現(xiàn)4個連續(xù)相同的堿基;
( 7 ) 3’端的熱力學穩(wěn)定性低于5'’ 端;
(8)第19個堿基為"A" ;
(9)第18個堿基為"A"或者“T”，"A”更優(yōu);
( 10)第7個堿基為“T” 較佳;
( 11)第20~ 23個堿基(即靶片段3’端)為"A”或者"T”;
(12 )避免出現(xiàn)易受DNA甲基化影響的位點,如CpG島、CpG位 點和GC富集區(qū)域等。
目前，篩選合適的saRNA靶位點比較困難,通常需要設計多個saRNA分子用于篩選。