CRISPRi、CRISPRa 基因抑制、基因激活saRNA
1、CRISPRa 基因激活技術(shù)，作用靶標(biāo)：DNA, 無需改變堿基序列，無需基因合成過表達(dá)載體構(gòu)建，激活效率幾倍，幾十倍或更高。 我們的數(shù)據(jù)40倍激活
2、CRISPRi 基因抑制技術(shù)，作用靶標(biāo):DNA, 無需改變堿基序列，同時抑制多個轉(zhuǎn)錄本，核內(nèi)核外RNA均可以被抑制。
另基因抑制和激活技術(shù)小核酸技術(shù) ：小干擾siRNA, 小激活saRNA，需要更多信息請聯(lián)系我們。
小激活saRNA
saRNA的分子機(jī)制及設(shè)計原則
saRNA作用于基因調(diào)控序列的特異位點(diǎn),誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄,這已經(jīng)得到學(xué)者們的普遍認(rèn)同,并
成為新的腫瘤研究熱點(diǎn)。然而, RNAa的細(xì)胞分子機(jī)制目前尚不完全明確。saRNA- 般是
21 nt的外源性短雙鏈RNA。導(dǎo)入細(xì)胞質(zhì)的saRNA與Ago-2 ( Argonaute-2 )蛋白形成
saRNA-Ago-2復(fù)合物。Ago- 2為saRNA-Ago-2復(fù)合物的形成提供平臺,并引愎合物進(jìn)入細(xì)
胞核。saRNA-Ago- 2復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中形成,但其進(jìn)入細(xì)胞核的機(jī)制仍不清楚。進(jìn)入細(xì)胞核
的saRNA-Ago-2復(fù)合物在引導(dǎo)鏈的指引下靶向結(jié)合于DNA啟動子序列的特異位點(diǎn),并通過組
蛋白修飾酶改變局部空間構(gòu)象及組蛋白乙酰化狀態(tài),從而上調(diào)目的基因表達(dá)。研究表
明, saRNA誘導(dǎo)的基因激活可能受DNA超甲基化的影響,所以應(yīng)避免saRNA靶序列中存在
CpG島。然而, DNA超甲基化對RNAa的抑制作用是否具有普遍性或基因特異性仍不明確。
RNAa誘導(dǎo)的基因表達(dá)上調(diào)需在saRNA轉(zhuǎn)染24 ~ 48 h后才能檢測到,在4~ 5 d后達(dá)到高峰,
并持續(xù)10 d以上。由此說明, RNAa具有獨(dú)特的動力學(xué)特征。目前,對于saRNA作用的具體分
子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。
RNAa涉及復(fù)雜的分子調(diào)節(jié)機(jī)制,可能影響RNAa效率的表觀遺傳因素尚不明確。因此，目前
對于saRNA并無規(guī)范的設(shè)計方法。綜合分析前期實驗和文獻(xiàn)報道，上海吉熒生物總結(jié)saRNA的設(shè)計原則如下:
(1)目標(biāo)靶點(diǎn)選擇在DNA正義鏈序列上;
( 2 )與DNA正義鏈互補(bǔ)的RNA鏈作為導(dǎo)鏈,
DNA鏈的3’端與RNA鏈的5’ 端相對應(yīng);
( 3 ) saRNA靶點(diǎn)選取在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游200 ~1 200 bp;
( 4 ) saRNA長度為21 bp ,在saRNA 3’端懸掛dTdT或者UU ;
( 5) GC含量為40%~65%;
( 6)靶片段中避免出現(xiàn)4個連續(xù)相同的堿基;
( 7 ) 3’端的熱力學(xué)穩(wěn)定性低于5'’ 端;
(8)第19個堿基為"A" ;
(9)第18個堿基為"A"或者“T”，"A”更優(yōu);
( 10)第7個堿基為“T” 較佳;
( 11)第20~ 23個堿基(即靶片段3’端)為"A”或者"T”;
(12 )避免出現(xiàn)易受DNA甲基化影響的位點(diǎn),如CpG島、CpG位 點(diǎn)和GC富集區(qū)域等。
目前，篩選合適的saRNA靶位點(diǎn)比較困難,通常需要設(shè)計多個saRNA分子用于篩選。