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sgRNA設計、高效率靶點載體構建、活性篩選

1、根據客戶提供的基因信息，設計并構建至少3條或3對cas9/sgRNA表達載體，在293細胞或目的細胞中進行活性篩選，最后提交錯配酶切結果及構建好的sgRNA表達載體。

圖：sgRNA活性篩選T7E1測試結果

2、高效率靶點載體構建（適用于哺乳動物細胞）

（新穎的cas9表達系統，高效的編輯效率，省時，省費用！）

CRISPR/Cas9基因編輯，即Cas9酶在gRNA引導下，靶向基因組并剪斷DNA，形成DNA雙鏈斷裂（DSB），細胞通過NHEJ和HDR兩種方式對DSB進行修復，進而產生片段或堿基缺失，插入，替換等，利用該特點進行基因敲除（KO）和敲入(KI)。改造后的CRISPR/Cas9還可以實現基因激活、抑制和表觀遺傳調控等。

細胞基因編輯中幾個重要的影響因素：

1、        合適的Cas9酶和gRNA表達系統（哺乳動物可選擇表達系統較多）

2、        設計篩選到高活性gRNA靶點（一般設計3-6個靶點進行篩選，費時步驟）

3、        CRISPR質粒的導入（轉染效率低的細胞編輯效率很低，實驗很難進行）

4、        單克隆篩選（如果編輯效率低，將更加費時費力）

吉熒生物提供新型CRISPR 表達系統，上述問題迎刃而解!

原理：該載體是一種可以在細胞中復制的載體，就像普通質粒在細菌中復制一樣。高效CRISPR質粒上包含了所有基因編輯元件和篩選基因，屬于All-In-One vector，使用非常簡單，只要將質粒轉入細胞中，用嘌呤霉素篩選幾天就可以敲除基因，效率可高達100%（見下圖）。

高效CRISPR的優點總結如下：
1. 可以長時間編輯細胞，實現高效的基因敲除
2. 載體含有Puromycin抗性基因，可以富集轉染成功的細胞，不受轉染效率影響
3. 載體含有GFP，可以監測轉染效率，還可以用流式分選細胞
4. 載體可以同時表達兩個gRNA，編輯兩個基因或者敲除一段DNA片段
5. 撤除篩選藥物后，高效表達質粒在一周內迅速丟失，編輯好的細胞不再含有外源基因

載體圖及案例展示

第15天獲得接近100%的編輯效率！（酶切位點的突變）

訂購注意事項：

1、        您提供基因名稱（基因ID）

2、        我們提供構建好gRNA靶點的高效CRISPR載體(含puro，GFP雙篩選標記)

周期約10工作日

參考文獻：[1] Xie et al. An episomal vector-based CRISPR/Cas9 system for highly efficient gene knockout in human pluripotent stem cells. Sci Rep. 2017 May 24;7(1):2320.