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mMESSAGE mMACHINE^® Kit

 

— — High Yield Capped RNA Transcription Kit

 

Data from GeneBio , mRNA for injection & transfection

 

原 理：

轉(zhuǎn)錄試劑盒是專門設(shè)計(jì)用于體外高產(chǎn)量合成帽狀RNA（即合成RNA的5端帶帽狀結(jié)構(gòu)），帽狀RNA模擬了大多數(shù)真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的mRNA結(jié)構(gòu)。試劑盒內(nèi)的帽狀類似物[m7G(5)ppp(5)G]與4種核苷酸混合在單一溶液內(nèi)，簡化了反應(yīng)步驟。另外帽狀類似物：GTP經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)為1:4，最大化轉(zhuǎn)錄生成RNA和帽狀RNA所占比例。20ul的反應(yīng)體系加入1µg DNA模板在2h內(nèi)可以體外合成15-35 µg 7-甲基鳥苷帽狀RNA，其產(chǎn)量是傳統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的10-50倍。

優(yōu) 勢：

1）一步法直接合成帶帽狀結(jié)構(gòu)的RNA，其結(jié)構(gòu)與大多數(shù)真核生物體內(nèi)的mRNA結(jié)構(gòu)相同；

2）試劑盒內(nèi)酶混合液含RNase抑制劑，保護(hù)RNA不被降解；

3）試劑盒含對照模板（ Xenopus elongation factor 1a, pTRI Xef），以檢測試劑盒的轉(zhuǎn)錄效率；

應(yīng) 用：

帽狀RNA可直接用于下游實(shí)驗(yàn)：顯微注射入卵母細(xì)胞，體外翻譯，轉(zhuǎn)染或者其他。

試劑盒成分：（25 reactions）

1.75 ml， Nuclease-free Water。

50 μL Enzyme Mix (SP6, T7, or T3)，50%甘油緩沖液含RNA聚合酶、Rnase抑制劑和其他。

50 μL，10X Reaction Buffer (SP6, T7, or T3) ，含鹽類、緩沖液、DTT和其他成分。

250μL，2X NTP/CAP (SP6, T7, or T3)，一種中性緩沖液含有ATP/CTP/UTP/GTP/帽狀類似物。

100μL GTP，20 mM in SP6 Kits; 30 mM in T3 and T7 Kits。

100 μL，TURBO DNase (2 U/μL)。

10 μL，pTRI-Xef, 0.5 mg/mL (Control Template)。

1 ml，Ammonium Acetate Stop Solution。

1.4 mL，Lithium Chloride Precipitation Solution。

1.4 mL，Gel Loading Buffer II。

實(shí)驗(yàn)材料（自行準(zhǔn)備）：

DNA模板：待轉(zhuǎn)錄的DNA序列上游必須帶有正確的RNA聚合酶啟動(dòng)位點(diǎn)（T7，T3或SP6）；

標(biāo)記核苷酸(選擇性)：[α-³²P] UTP or [α-³²P]CTP可加入反應(yīng)體系用作追蹤元素，方便定量檢測RNA合成量；

合成RNA純化試劑（選擇性）：緩沖液或飽和酚/氯仿，異丙醇，離心柱；

DNA模板（注意事項(xiàng)）：

（1）試劑盒選擇：根據(jù)帶轉(zhuǎn)錄的DNA序列上游帶有的RNA聚合酶啟動(dòng)位點(diǎn)（T7，T3或SP6）選擇對應(yīng)的試劑盒；

（2）模板濃度：推薦使用0.5 μg/μL水溶液或TE溶液；

（3）模板大小：最佳長度是0.3-5.0kb，可用于更長或更短的模板，需適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)條件；

（4）模板方向：若合成sense RNA(正義RNA)，使用RNA聚合酶對應(yīng)的細(xì)菌啟動(dòng)子在5端或者蛋白質(zhì)編碼區(qū)的N末端；如果模板含有質(zhì)粒，經(jīng)多克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶線性化后啟動(dòng)子處于相反位置；若合成antisense RNA（反義RNA），使用RNA聚合酶對應(yīng)的細(xì)菌啟動(dòng)子在3或者蛋白質(zhì)編碼區(qū)的C末端；

產(chǎn)品信息：現(xiàn)貨供應(yīng)！

 

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